Глава 4 ТРОМБОФИЛИИ. ЭТИОЛОГИЯ И ПАТОГЕНЕЗ. МАРКЕРЫ ТРОМБОФИЛИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ

Тромбофилия, по определению Британского комитета по гематологическим стандартам, это врожденный или приобретенный дефект гемостаза, приводящий к высокой степени предрасположенности к тромбозам. Российские гемостазиологи предлагают более полное определение этого патологического состояния: тромбофилия — это нарушения гемостаза и гемореологии, которые характеризуются повышенной наклонностью к развитию тромбозов кровеносных сосудов и ишемией органов.

По данным некоторых исследований, тромбофилия, врожденная или приобретенная, выявляется более чем у 60% пациентов с венозными тромбозами. Чаще всего врожденные тромбофилические состояния клинически проявляются в виде идиопатических венозных тромбозов, возникающих в молодом возрасте [Cushman M., 2007].

Существует несколько классификаций тромбофилических состояний. Одна из них, наиболее обширная и полная, была разработана и предложена З. С. Баркаганом и его сотрудниками в 1996 г. Она включает в себя 10 больших групп, которые отражают изменения на различных уровнях системы гемостаза.

1. Гемореологические формы, характеризующиеся полиглобулинеей, повышением гематокритного показателя, повышением вязкости крови и/или плазмы (в сочетании с гипертромбоцитозом или без него).

2. Формы, обусловленные нарушениями тромбоцитарного гемостаза, связанные с гипертромбоцитозом, повышением агрегационной функции тромбоцитов (спонтанной и под воздействием основных агонистов), уровнем и мультимерностью фактора Виллебранда.

3. Формы, связанные с дефицитом и/или аномалиями первичных физиологических антикоагулянтов — протеинов С и S, антитромбина III, TFPI.

4. Формы, связанные с дефицитом или аномалиями плазменных факторов свертывания крови — аномалией фактора Vа и резистентностью его к активированному протеину С, аномалией фактора II, тромбогенными дисфибриногенемиями.

Таблица 4.1. Факторы риска венозных тромбозов и тромбоэмболических осложнений

5. Формы, связанные с нарушениями фибринолиза — дефицитом или аномалией тканевого активатора плазминогена (ТПА) и самого плазминогена, избытком их ингибиторов.

6. Формы, связанные с повышением активности и недостаточной инактивацией фактора VII.

7. Аутоиммунные и инфекционно-иммунные формы, в том числе так называемый антифосфолипидный синдром; болезнь Бехчета, тиреотоксикоз, системные васкулиты, бактериальный эндокардит, сепсис.

8. Паранеопластические формы: висцеральные формы раковых опухолей различных локализаций (синдром Труссо и др.).

9. Метаболические формы — диабетические ангиопатии, гиперлипидемические формы, тромбофилия при гипергомоцистеинемии и др.

10. Ятрогенные (в том числе медикаментозные) формы — связанные с приемом гормональных контрацептивов, гепарина, фибринолитической терапией, лечением L-аспарагиназой и др. Для оценки вероятности наличия тромбофилии, можно использовать упрощенную классификацию [Meissner M. H., Gloviczki P., 2009], которая разделяет все основные факторы риска развития венозных тромбозов и тромбоэмболических осложнений на врожденные, приобретенные, ситуационные (преходящие) и сочетанные (табл. 4.1).

Приобретенные и ситуационные тромбофилии

Одним из значимых факторов риска развития венозных тромбозов, являющимся по сути приобретенным тромбофилическим состоянием, является пожилой и старческий возраст. С возрастом в системе свертывания крови происходят изменения, характеризующиеся склонностью к гиперкоагуляции; кроме того, с увеличением возраста значительно снижается двигательная активность, развиваются и нарастают изменения в венозной системе нижних конечностей. Что касается возрастного компонента, то известно, что в популяции до 45 лет венозный тромбоз чаще возникает у женщин, а в старшей возрастной категории эпизоды венозного тромбоза и тромбоэмболических осложнений регистрируются у пациентов мужского пола.

Хирургическое вмешательство и травма представляют собой наиболее яркий пример сочетания всех трех компонентов триады Вирхова. Основными факторами, приводящими к развитию тромбофилического состояния, становятся иммобилизация (иногда длительная), активация коагуляционного каскада в результате повреждения сосудистой стенки, развития кровотечения различной степени тяжести, а также угнетение системы фибринолиза, выражающееся в повышении уровня ингибитора активатора плазминогена. При проведении оценки риска развития венозных тромбоэмболических осложнений у хирургических пациентов и пациентов травматологического профиля необходимо принимать во внимание и наличие других факторов риска — возраст, объем вмешательства, характер травматических повреждений, наличие сопутствующих заболеваний и т. д.

Беременность всегда сопровождается состоянием гиперкоагуляции, что связано с повышением уровня фибриногена, протромбина, развивается так называемая гравидарная тромбинемия, значительно — на 50—80% — возрастает уровень FVIII, FIX, FX факторов свертывания крови. Одновременно снижается активность системы фибринолиза и физиологических антикоагулянтов: повышается активность ингибитора активатора плазминогена, с одновременным повышением уровня активаторов плазминогена — t-PA, u-PA, FXII. С увеличением срока беременности происходит снижение скорости кровотока в венах нижних конечностей, обусловленное сдавлением нижней полой вены беременной маткой, что дополнительно создает условия для образования тромбов в просвете вен. Частота встречаемости венозных тромбозов, тромбоэмболических осложнений на фоне беременности составляет 0,7— 1,3 на 1000, что почти в 10 раз выше, чем среди небеременных женщин фертильного возраста [Макацария Б., 2003].

Еще одним серьезным фактором, способным привести к развитию приобретенной тромбофилии, является прием гормональных препаратов, в первую очередь это оральная контрацепция и гормонозаместительная терапия. Риск развития венозных тромбоэмболических осложнений у женщин, принимающих оральные контрацептивы, наиболее высок в течение первого года приема препарата, в дальнейшем опасность тромбозов постепенно снижается. Прием оральных контрацептивов приводит к снижению уровня физиологических антикоагулянтов — протеина С, протеина S, антитромбина III, наблюдается преходящая резистентность FV к протеину С, подобная таковой при наличии Лейденской мутации. «Заинтересованной» оказывается и система фибринолиза — в виде снижения ее активности. Несмотря на то что данных о влиянии оральных контрацептивов на систему гемостаза существует на сегодняшний день достаточно, до сих пор остается неясным, какой именно механизм является пусковым в увеличении риск тромбообразования. Ясно одно — что сочетание приема гормональных контрацептивов и наличие генетической тромбофилии, варикозной болезни нижних конечностей, других сопутствующих заболеваний значительно повышает риска развития тромбоэмболических осложнений, вплоть до фатальных. Влияние заместительной гормональной терапии на изменения в свертывающей системе крови сопоставимо с влиянием оральных контрацептивов, однако риск венозных тромбозов у женщин, принимающих гормональные препараты в период менопаузы, выше, по сравнению с фертильными женщинами, получающими гормоны с целью контрацепции. Связан такой факт с наличием у женщин старшего возраста сочетания нескольких значимых факторов риска тромбообразования.

Патологические изменения, возникающие при онкологических заболеваниях и приводящие к развитию тромбоэмболических осложнений, обусловлены целым комплексом факторов — общие, включающие в себя реакцию организма на наличие злокачественного новообразования, а также факторы, связанные с активностью самой опухоли. Особенностью изменений в системе гемостаза при онкологических заболеваниях является сочетание активации как тромбоцитарного, так и плазменного звеньев гемостаза. Пусковым механизмом гиперкоагуляции является тканевый фактор, уровень которого в плазме крови повышается в результате его гиперпродукции опухолевыми клетками, в результате чего происходит активация FIX и FX с дальнейшем развитием каскада свертывания крови. Кроме того, в сложный процесс включаются цитокины, в том числе фактор некроза опухолей TNF-α, а также специфические онкологические прокоагулянты, такие как Сазависимая цистеиновая протеаза. Изменения в тромбоцитарном звене гемостаза также обусловлены активностью опухоле-вых клеток, что приводит к усилению спонтанной агрегации тромбоцитов, а значит и повышению риска тромбообразования на фоне уже свершившихся изменений в системе плазменного гемостаза и системе фибринолиза. В терминальных стадиях неконтролируемые патологические процессы в каскаде свертывания крови, нередко приводят к срыву с развитием ДВС-синдрома, зачастую с фатальным исходом [Котельников М. В., 2006; Manly D. A. et al., 2011].

Врожденные тромбофилии

Врожденные (генетические) тромбофилии связаны с нарушением структуры генов определенных белков, которые принадлежат к системе свертывания крови.

Чтобы перейти к обсуждению врожденных тромбофилий, необходимо определить некоторые генетические понятия.

Ген — участок молекулы ДНК, в котором закодирована информация о биосинтезе одной полипептидной (белковой) цепи с определенной аминокислотной последовательностью. Ген является единицей наследственного материала, он обеспечивает формирование какого-либо признака организма и его передачу в ряду поколений. Гены контролируют все клеточные процессы на молекулярном уровне, обеспечивая биосинтез белков, в первую очередь ферментов.

Аллель (аллельный вариант) — одна из возможных форм одного и того же гена. Аллели расположены в одинаковых участках (локусах) гомологичных (парных) хромосом; определяют варианты развития одного и того же признака, контролируемого данным геном.

Генетический полиморфизм (полиморфный вариант, однонуклеотидный вариант, SNP) — представляет собой замену одного из нуклеотидов — A, C, T, G — на другой в последовательности ДНК.

Гомозигота (гомозиготный вариант) — вариант, когда два гена, определяющие какой-либо конкретный признак, одинаковы, т. е. пара аллелей — отцовский и материнский — идентичны.

Гетерозигота (гетерозиготный вариант) — вариант, когда два гена, определяющие какой-либо определенный признак, различны, т. е. пара аллелей — отцовский и материнский — не одинаковы.

«Дикий тип» — фенотип или совокупность фенотипов, присущие большинству особей природных популяций данного вида.

Итак, аллели или аллельные варианты — это различные по структуре участки одного и того же гена, расположенные в гомологичных хромосомах и определяющие альтернативные варианты проявления того или иного признака. Если аллели различны по своей структуре, то говорят о гетерозиготе, если одинаковы — это гомозиготный вариант. Различия в нуклеотидной последовательности аллельных вариантов могут быть обусловлены различными механизмами. Для изменений в генах системы гемостаза характерно появление точечных однонуклеотидных замен, или полиморфизмов, в кодирующих последовательностях генов, что обусловливает изменения в структуре РНК и, следовательно, в структуре компонента системы гемостаза из-за замены той или иной аминокислоты на другую. Изменение первичной структуры протеина может приводить к изменению его функции и функциональной активности либо оставаться незамеченным, чем объясняется неодинаковая роль однонуклеотидных замен в различных участках ДНК одного гена. Несмотря на то что некоторые генетические изменения, характерные для врожденных тромбофилий, уже описаны, в настоящее время очень интенсивно ведется поиск новых кандидатных однонуклеотидных замен, которые могли бы объяснить наличие тромбоэмболических осложнений при отсутствии известных маркеров. Молекулярнобиологически изменения в ДНК, как правило, являются миссенс-мутациями (замена аминокислоты вследствие замены нуклеотида) и значительно реже — нонсенс-мутациями (однонуклеотидная замена образует стоп-кодон и нарушается синтез фермента). В случае если происходит изменение функциональной активности компонента системы гемостаза, возможны два исхода — снижение функции вплоть до ее потери или усиление действия в точке приложения, loss-of-function и gain-of-function соответственно. При этом, очевидно, происходит дисбаланс в системе гемостаза, клинико-лабораторная манифестация которого зависит от степени его компенсации. По типу gain-of-function происходят изменения функции FV и протромбина, loss-of-function наблюдается при картине дефицита фактора гемостаза — примером являются тромбофилии, связанные с дефицитом естественных антикоагулянтов.

Врожденные тромбофилии условно можно разделить на несколько групп:

1-я группа — дефицит физиологических антикоагулянтов, в том числе дефицит антитромбина III, протеина С и протеина S;

2-я группа — повышение уровня или активности факторов плазменного гемостаза — резистентность к активированному протеину С (мутация Лейден), мутация в гене протромбина, повышение уровня VIII, IX, XI факторов свертывания крови;

3-я группа — патология системы фибринолиза;

4-я группа — гипергомоцистеинемия.

Наиболее часто встречающиеся виды тромбофилических состояний относятся к 1-й группе, однако более «тромбогенными» являются нарушения, которые входят в группу 2. По результатам многочисленных исследований установлены этиологические факторы врожденных тромбофилий, а также кандидатные маркеры предрасположенности к тромбозу (табл. 4.2) [Khan S., Dickerman J. D., 2006].

Таблица 4.2. Генетические факторы врожденных тромбофилий

В каких случаях можно заподозрить наличие у пациента врожденной тромбофилии? Наиболее характерным является развитие первого тромбоза в молодом возрасте (до 40 лет); нетипичная локализация тромба — повод для проведения углубленного исследования, так же как и рецидивы тромбозов и глубоких, и подкожных вен, развитие тромбозов на фоне проведения гормональной терапии, осложненные формы венозного тромбоза. При выявлении тромботических осложнений после травм и операций также необходимо выполнение генетического тестирования для исключения тромбофилического статуса. Исследование полиморфных вариантов генов системы гемостаза необходимо всем пациентам со свершившимися венозными тромбоэмболическими осложнениями с целью верификации врожденной тромбофилии и составления персонифицированной схемы лечения имеющегося заболевания, профилактики развития тромбоэмболических осложнений, а также рецидивов тромботических эпизодов. Кроме того, представляется целесообразным проводить генотипирование детям пациентов, страдающих тяжелыми, рецидивирующими формами тромбоэмболических осложнений, а также умерших от тромбоэмболии, для составления индивидуального плана профилактических мероприятий.

Методы диагностики тромбофилий основаны на расшифровке нуклеотидной последовательности участка ДНК с целью выявления точечной однонуклеотидной замены. Для решения этой задачи существует несколько методов.

Метод ПДРФ — полиморфизм длин рестрикционных фрагментов — основан на высокоспецифичной детекции определенных участков ДНК ферментами рестриктазами с последующей рестрикцией. Полученные фрагменты различаются по молекулярной массе, что можно выявить при электрофорезе в геле. Рестриктазы идентифицируют строго определенную нуклеотидную последовательность, и в случае однуклеотидной замены рестрикция не произойдет или произойдет в другом месте (зависит от конкретного гена). Это будет определять полиморфизм длин рестрикционных фрагментов при электрофорезе.

Метод ПЦР в реальном времени основан на многократном избирательном копировании определенного участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В этом методе используют флюоресцентно-меченные праймеры или пробы для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления; или используется флюоресцентный интеркалирующий краситель, который связывается с двухцепочечной ДНК. Судить о наличии той или иной однонуклеотидной замены можно по сигналу от флюоресцирующих праймеров.

Аппаратное определение с использованием секвенирования и микрочипов — наиболее современный и активно разрабатываемый раздел диагностики, обладающий высокой чувствительностью и специфичностью (до 99,9%) и позволяющий в автоматизированном режиме производить анализ генетического материала в кратчайшие сроки — от 1 до 8 дней. В работе секвенаторов и анализаторов биочипов используется принцип секвенирования путем синтеза: к исследуемой нуклеиновой кислоте пришивается короткий праймер с известной последовательностью, и при комплементарном синтезе прибор осуществляет детекцию последовательности использованных нуклеотидов. Современные возможности позволяют исследователям за один цикл работы аппарата обнаружить до 5 млн однонуклеотидных замен, проанализировать структурные вариации генома и экспрессию генов, а также произвести полногеномное секвенирование.

Врожденная тромбофилия. Генотип и фенотип

Для всех известных маркеров врожденных тромбофилий описан механизм их патогенетического действия. Однако подробно останавливаться представляется необходимым лишь на тех генетических факторах, роль которых в развитии венозных тромбозов достоверно доказана.

Тромбофилия, связанная с наследственным дефицитом антитромбина III, обусловлена структурными изменениями в ге-не SERPINC1, расположенном на коротком плече 1-й хромосомы, вследствие чего первичная белковая структура антикоагулянта изменяется. Описано около 120 точечных замен для данного гена, однако клиническое значение имеют лишь некоторые из них, что делает проведение генетического исследования нецелесообразным, необходимо лишь изучение периферического гемостаза. Тип наследования — аутосомно-доминантный. Антитромбин III является ингибитором сериновых протеаз — активированных факторов свертывания крови — FIa, FXa, FIXa, FXIIa — на поверхности эндотелиоцитов. Эта функция обеспечивается гепаринсвязывающим доменом на N-конце протеина. Известны два типа наследственного дефицита АТ III: при типе I наблюдается уменьшение количества антитромбина и его дисфункция, обусловленная мутациями, приводящими к нарушению рамки считывания. Тип II характеризуется нормальным количеством антитромбина, но функция его нарушена вследствие миссенс-мутаций в гене SERPINC1 и соответствующих замен аминокислот в первичной структуре антитромбина. Тип II подразделяется на три подтипа в зависимости от локализации замены в структуре фермента. Показано, что полиморфизм в локусе rs2 227 589 имеет достоверное влияние на анти-FXа-активность плазмы и снижение уровня антитромбина. Дефицит антитромбина III встречается в 0,07—0,2% случаев в популяции и выявляется у 0,5—8,0% пациентов с венозными тромбозами [Шиффман Ф. Дж., 2000; Шевела А. И. и др., 2008; Antуn A. I. et. al., 2009].

Врожденный дефицит протеина С обусловлен преимущественно миссенс-мутациями в гене PROC, локализованном на 2-й хромосоме, на сегодняшний день известно 160 видов полиморфных замен в гене этого белка. Наследование происходит аутосомно-доминантно. Фенотипически мутации могут проявляться так же в виде двух фенотипов: сниженный синтез (тип I) и нарушенный синтез (тип II). Основной функцией протеина С является ингибирование активированных факторов свертывания V и VIII после взаимодействия с тромбином, связанным с тромбомодулином. Кофактором ингибирования является протеин S. Изменения в структуре молекулы протеина С могут выявляться в различных участках — в домене протеазы, в сайте расщепления тромбина. Риск развития венозных тромбозов у пациентов — носителей полиморфных вариантов по редкому аллелю гена протеина С в 3 раза выше, чем у пациентов с диким типом. У пациентов старше 40 лет, страдающих венозным тромбозом и/или тромбоэмболическими осложнениями, тот или иной полиморфизм гена протеина С выявляется примерно в 50% случаев.

Дефицит протеина S также имеет врожденный аутосомнодоминантный тип наследования однонуклеотидных замен в структуре двух генов, расположенных на 3-й хромосоме. По-добно дефициту протеина С, описано два фенотипических варианта нарушений в системе свертывания.

Для тромбофилий, обусловленных дефицитом протеина С или S, описано большое число структурных изменений в кодирующих последовательностях, более 90% клинически значимых мутаций являются точечными однонуклеотидными заменами. Делеции, инсерции и другие изменения встречаются менее чем в 10% случаев. Дефицит протеина S выявляется примерно у 0,03—0,2% населения, однако истинная частота встречаемости остается неизвестной до сих пор [Шиффман Ф. Дж., 2000; Rau J. C. et. al., 2007].

V коагуляционный фактор — FV 1691 G → A (R506Q) (мутация Лейден) — мутация фактора V Лейден — реализуется при замене аденина на гуанин в положении 1691 (G1691A) кодирующей последовательности, что обусловливает замену одной аминокислоты в первичной структуре белковой цепи — Arg506Gln. V коагуляционный фактор является кофактором, необходимым для трансформации протромбина в тромбин. Инактивируется протеином С. При наличии полиморфного варианта по редкому аллелю А происходит аминокислотная замена в сайте связывания активированного фактора с протеином С, что обусловливает невосприимчивость FV к инактивирующему действию протеина С. Кроме того, мутантный FV обладает дополнительной кофакторной активностью в инактивации FVIIIа активированным протеином С. Еще один механизм прокоагулянтного действия FV — усиление активации тромбина, активирующего ингибитор фибринолиза (TAFI). Эти механизмы приводят к возникновению феномена активированной протеин С-резистентности и удлинению активированного частичного тромбопластинового времени. В результате возникает неконтролируемое каскадное увеличение количества тромбина и как следствие — повышение риска развития тромбозов, сердечно-сосудистых заболеваний, а также некоторой акушерской патологии. Лейденская мутация встречается примерно у 5% представителей европеоидной расы. По данным разных литературных источников, частота встречаемости мутации Лейдена (гетерозиготная форма) у пациентов с венозными тромбозами в разных популяциях колеблется от 5 до 20%, гомозиготный же вариант выявляется у 1—3% пациентов. При этом носители гетерозиготного полиморфного варианта имеют риск развития тромботического процесса в 3—7 раз выше, чем пациенты с диким типом, а у носителей гомозиготного полиморфизма по редкому аллелю этот показатель превышает 50 раз [Шевела А. И. и др., 2008; Zoller B. et. al., 1999].

Тромбофилия, связанная с изменениями в гене протромбина, обусловлена заменой гуанина на аденин G → A в локусе 20 210, который расположен в некодирующем регионе на 3’-конце последовательности на 11-й хромосоме. Таким образом, мутация не затрагивает собственно структуру II коагуляционного фактора, однако ведет к повышению содержания тромбина в плазме крови. Молекулярный механизм этого феномена еще изучается; известно, что патогенетические изменения могут происходить на посттранскрипционном этапе, при нарушении связывания с сайтом регуляции белковой активности вследствие нарушения фолдинга протромбина. Молекулярной основой для нарушений является удлинение поли-Апоследовательности на 3′-конце продукта трансляции, что приводит к повышению активности процессинга и более эффективному образованию протромбина. Клинически это ведет к уже упомянутому повышению концентрации протромбина и, соответственно, сдвигу гемостатического равновесия в сторону гиперкоагуляции. Тем не менее описано много случаев бессимптомного гомозиготного носительства полиморфного аллеля гена протромбина (повышенный риск тромбообразования описан для гетерозигот, и в случае гомозиготы риск должен был бы повышаться). Описана также различная степень влияния полиморфизма на тромбозы разной анатомической локализации. Частота встречаемости полиморфных вариантов гена FII G20 210A, по данным литературы, составляет в среднем 2—3% у представителей европеоидной расы, примерно 5—10% пациентов с венозными тромбозами являются носителями редкого аллеля гена протромбина [Zoller B. et. al., 1999; Bosler D. et. al., 2006; Liu X. et. al., 2010].

Ключевым ферментом фолатного цикла является метилентетрагидрофолатредуктаза — MTHFR, которая переводит фолиевую кислоту в ее активную форму 5-метилтетрагидрофолат. Ген MTHFR локализуется на коротком плече хромосомы 1 (1р36.3) и состоит из 11 экзонов. Практическое значение имеют два полиморфизма: С677Т в экзоне 4 и А1298С в экзоне 7. Миссенс-мутация С677Т, связанная с замещением цитозина на тимин в положении 677, вызывает замену аланина на валин (p.Ala222Val) в каталитическом домене белка-фермента. У гомозигот по полиморфному аллелю активность фермента in vit ro снижена на 70%, а у гетерозигот — на 35%. Мутантный аллель 677Т распределен в популяциях с высокой гетерогенностью. Частота его встречаемости среди европейцев варьирует от 0,19% (у жителей Великобритании) до 0,55% (у испанцев). В России у жителей Мсковского региона частота встречаемости аллеля 677Т составляет 0,29%, у жителей Сибири — 0,32%.

Вторым распространенным полиморфизмом в этом гене является транзиция А1298С, приводящая к замене глутаминовой кислоты на аланин в регуляторном домене фермента (p.Glu429Ala). Аллель 1298С также снижает активность фермента, хотя и не так значительно, как аллель 677Т [Фетисова И. Н. и др., 2007; Гиляров М. Ю. и др., 2009; Loscalzo J., 2009].

Кроме перечисленных выше генов, для верификации диагноза врожденной тромбофилии проводят исследование и других генетических факторов.

1. Гены тромбоцитарного гемостаза:

Тромбоцитарный гликопротеин 1α (интегрин-альфа-2)

Gp-1α 807 C → T — определяет структуру одного из рецепторов тромбоцитов (интегрина), благодаря которому тромбоциты фиксируются к поврежденной стенке сосуда. При замене нуклеотида C на нуклеотид Т происходит повышение активности кодируемых геном рецепторов и, соответственно, увеличение скорости фиксации тромбоцитов к сосудистой стенке, что может приводит к повышению риска развития различных сердечно-сосудистых заболеваний.

Тромбоцитарный гликопротеин IIIα, интегрин β

GpIIIα 1565 Т → C (Leu33Pro) — ген рецептора тромбоцитов для фибриногена и фактора Виллебранда. Ген определяет агрегационную активность тромбоцитов, при наличии полиморфизмов по редкому аллелю, способность к агрегации у тромбоцитов резко увеличивается, что приводит к повышению риска развития сердечно-сосудистой патологии (инфаркты, инсульты, ранняя форма ИБС).

Тромбоцитарный гликопротеин 1β

Gp 1вα VNTR — кодирует аминокислотную последовательность 1-β-субъединицы рецепторов тромбоцитов. Посредством этих рецепторов осуществляется взаимодействие тромбоцита с поврежденной стенкой сосуда или атеросклеротической бляшки. Рецептор 1β содержит высокогликолизированный район, длина которого может варьировать. Укорочение может привести к ослаблению связывания фактора Виллебрандта. Более длинные варианты являются факторами риска по развитию тромбозов, инсультов, инфарктов в результате повышения адгезии тромбоцитов к эндотелию.

2. Гены коагуляционного гемостаза:

Фибриноген-β-пептид

FGB-455G → A — детерминирует активность фибриногена благодаря кодированию аминокислотной последовательности β-цепи фибриногена. Носительство редкого аллеля А сопровождается повышенной экспрессией гена, что приводит к повышению уровня содержания фибриногена в плазме крови и повышает риск развития сердечно-сосудистых заболеваний.

VII коагуляционный фактор

FVII 10 976 G → A (Arg353Gln) — VII фактор, активирует FIX и FX, инициируя каскад коагуляции. Наличие гетерозиготного или гомозиготного полиморфизма по редкому аллелю в гене FVII является протективным фактором по риску развития сердечно-сосудистых заболеваний, тромбозов и тромбоэмболий, так как сопровождается снижением концентрации FVII в плазме крови на треть от исходного, и активности прокоагулянтных реакций.

VIII коагуляционный фактор

FVIII 10 976 G → A (Asp1241Glu) — VIII антигемофильный фактор. В активном состоянии является кофактором FIXa, который в свою очередь воздействует на FX, активируя последний. Полиморфизм по редкому аллелю приводит к снижению активности FVIII, что является протективным фактором относительно риска развития сердечно-сосудистых заболеваний. Однако при сочетании указанного полиморфизма с мутацией в Х-хромосоме, определяющей развитие гемофилии А, отмечается более тяжелое течение заболевания.

FXII коагуляционный фактор

FXII С46Т — фактор свертывания крови, синтезируемый в гепатоцитах, являющийся инциирующим фактором в каскаде коагуляции и активатором системы фибринолиза путем воздействия на плазминоген. При снижении уровня FXII в плазме крови, обусловленном наличием в гене редкого аллеля, возрастает угроза развития как артериальных, так и венозных тромбозов, а также сердечно-сосудистых заболеваний в общем.

3. Гены системы фибринолиза

PLAT тканевой активатор плазминогена

PLAT-7351 C → T — является детерминирующим геном тканевого активатора плазминогена, основной функцией которого является трансформация плазминогена в плазмин. При наличии полиморфного варианта по редкому аллелю в указанном гене происходит значительное снижение выработки PLAT, что сопровождается снижением активности системы фибринолиза, повышением риска инсультов, инфарктов и венозных тромбоэмболических осложнений.

PAI-1 ингибитор активатора плазминогена

PAI-1 657 5G → 4G — определяет активность фермента ингибитора активатора плазминогена. При наличии в структуре гена полиморфизма по редкому аллелю отмечается повышение активности соответствующего фермента в различной степени в зависимости от типа аллельного варианта. В этом случае также снижается эффективность функционирования системы фибринолиза, сопровождающаяся повышенным риском тромбообразования как в венозной, так и в артериальной системе.

4. Гены фолатного цикла

Фолатный цикл — цепь биохимических реакций, в результате которых происходит превращение аминокислоты гомоцистеина в аминокислоту метионин. При снижении уровня ферментов, в том числе и вследствие генетических факторов, являющихся основой биохимических превращений, происходит увеличение концентрации гомоцистеина в плазме крови, что приводит к гиперпродукции гомоцистина, смеси дисульфидов и тиолактона гомоцистеина. Данные соединения способствуют повреждению эндотелия, обнажению субэндотелиального матрикса и гладкомышечных клеток. Кроме того, избыток гомоцистеина способствует активации XII и V факторов, а также экспрессии тканевого фактора; при этом нарушается высвобождение естественных ингибиторов коагуляции и антиагрегантов — протеина С, ингибитора внешнего пути свертывания крови; снижается гликозаминогликанзависимая активация антитромбина III, подавляется активность тромбомодулина. Наряду с этим наблюдается повышенная агрегация тромбоцитов вследствие снижения синтеза эндотелием оксида азота, а также усиленного высвобождения поврежденными эндотелиоцитами фактора Виллебранда. Снижение синтеза эндотелиальной оксида азота обусловлено уменьшением экспрессии синтазы азота за счет действия продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), инициируемого гомоцистеином. Обозначенные атерогенные и тромбофилические эффекты в совокупности определяют хроническую эндотелиальную дисфункцию при гипергомоцистеинемии. Частота выявления гипергомоцистеинемии в общей популяции составляет 5%.

MTR метионинсинтаза

MTR 2756 A → G (D919G) — влияет на структуру и функцию фермента метионинсинтаза, который при участии кофактора витамина В12 принимает участие в реакции фолатного цикла. Генетические нарушения приводят к повышению уровня гомоцистеина и понижению уровня S-аденозилметионина, что является определяющим фактором для развития некоторых видов акушерской патологогии, а также повышенным риском тромбообразования.

CBS цистатион-β-синтаза

CBS 844ins68 — фермент, участвующий в реакции соединения серина и гомоцистеина, с превращением последнего в цистатион. Реакция происходит при участии в качестве ко-фактора витамина В 6. При наличии полиморфизма по редкому аллелю в гене цистатион-β-синтазы может привести не только к гипергомоцистеинемии, но и к гомоцистеинурии. Показано, что генетические отклонения в этом гене в совокупности с другими нарушениями ферментативной активности в фолатном цикле могут приводить к повышенному риску тромбообразования.

MTRR метионинситаза-редуктаза

MTR 66 A → G (I22M) является геном, детерминирующим работу фермента метионинсинтаза-редуктазы, который участвует в нескольких реакциях метилирования фолатного цикла, в том числе определяет эффективность обратного превращения гомоцистеина в метионин. Имеет определяющее значение в переводе метионинсинтазы в активную форму. При наличии полиморфизма 66 A → G возрастает риск развития сердечнососудистых заболеваний на фоне гипергомоцистеинемии.

5. Гены эндотелия

END1 эндотелин

END1 G5665T Lys198Asn — вазопрессорный пептид, продуцируемый эндотелием сосудов под действием различных ферментов и белков, таких как адреналин, тромбин, вазопрессин, а также при повреждении сосудов. Возможно, что при наличии полиморфизма в гене эндотелина 1 происходит реактивное изменение активности других белков сосудистого эндотелия, в том числе протромботических, что повышает риск тромбообразования и утяжеляет течение заболевания.

NOS(e) — эндотелиальная NO синтаза

NOS(e) VNTR и C → T — основные функции фермента NOS(e) — участие в процессах ангиогенеза, снижении агрегационной способности тромбоцитов, релаксации гладкомышечных элементов сосудистой стенки. Наличие указанных вариантов полиморфизмов в гене NOS(е) влияет на повышение риска развития сердечно-сосудистых заболеваний и их осложнений, в том числе инсультов, инфарктов, ИБС.

Объем генетической диагностики не должен быть одинаковым у пациентов с различными клиническими ситуациями, в связи с чем разработаны несколько вариантов (панелей) для генетического исследования системы гемостаза:

1. Основная (базовая) панель: исследование полиморфных вариантов генов FV, FII, MTHFR. Этот вариант может быть использован в качестве скринингового, при выявлении носительства хотя бы одного редкого аллельного варианта необходимо проведение расширенного генетического исследования.

2. Стандартная панель: исследование полиморфных вариантов генов FV, FII, FGB, FXII, PAI-1, MTHFR, MTHFD, CBS. Стандартный набор генов для проведения рутинного исследования.

3. Расширенная панель: исследование полиморфных вариантов генов FV, FII, FGB, FVII, FVIII, FXII, PAI-1, PLAT, MTHFR, MTHFD, CBS, MTR, MTRR, END1, NOS(e). Расширенный вариант генетической панели рекомендуется применять для исследования у пациентов с тромбоэмболией, рецидивными тромбозами.

В 2012 г. в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск) был окончен очередной этап многолетнего исследования частоты встречаемости полиморфных вариантов генов системы гемостаза у пациентов Западно-Сибирского региона с венозными тромбозами и тромбоэмболическими осложнениями. Подробные результаты исследования представлены в табл. 4.3.

По полученным данным, частота встречаемости редкого аллеля гена фактора свертываемости FV в гомозиготном варианте у пациентов с венозными тромбозами составляет 1,42%, а носительство гетерозиготного варианта выявлено у 13,48% пациентов. Наличие редкого аллеля в гене FV достоверно повышает риск развития венозного тромбоза и тромбоэмболических осложнений в 6,5 раза (χ2 = 16,81, р<0,01, OR = 6,5). Полученные результаты несколько отличаются от общемировых данных. По литературным источникам, в Италии наличием редкого аллеля в гене FV объясняют до 43,7% всех венозных тромбозов, а в клинически здоровой популяции этой страны количество носителей мутантного аллеля составляет около 12%. При сравнении частоты встречаемости полиморфизмов по редкому аллелю FV среди афроамериканцев и европеоидов в США, мутантный аллель достоверно чаще встречается в европеоидной популяции (р<0,03), общая частота встречаемости составляет 4,9%. Та же цифра получена в исследовании в Португалии. В Ливане носителями Лейденской мутации являются до 14,4% всего населения. В Бразилии их несколько меньше — примерно 10%. По данным российских исследователей, частота встречаемости гетерои гомозиготного полиморфизмов гена FV G506A гена F5 (мутация Лейден) в популяции Центрального и Северо-Западного регионов значительно меньше, чем в европейских странах, и составляет 2,6—3,8% [Калашникова Е. А. и др., 2006; Гиляров М. Ю. и др., 2009; Limdi N. A. et. al., 2006; Branco C. C. et. al., 2009; Kreidy R. et. al., 2009; Gessoni G. et.al.,2010].

При анализе результатов нашего исследования выявлено также достоверное влияние генетических изменений в гене метилентетрагидрофолатредуктазы MTHFR C677T на риск развития венозного тромбоза, частота встречаемости редкого аллеля этого гена у пациентов с тромботическим процессом в венах нижних конечностей достигает 48,23% в гетерозиготном варианте и 9,2% при гомозиготной форме полиморфизма. Риск развития заболевания при наличии мутации в гене MTHFR C677T почти в 2 раза выше, чем в случае отсутствия редкого аллеля (χ2 = 6,61, р = 0,01, OR = 1,8). Вообще мутантный аллель 677Т распределен в популяциях с высокой гетерогенностью. Его частота среди европейцев варьирует от 19% у жителей Великобритании до 55% у испанцев. В азиатских популяциях мутантный аллель распределяется с частотой от 25% (у индонезийцев) до 38% (у китайцев); на Африканском континенте — от полного отсутствия у представителей племени денди до 9% у народности берба. В Новом Свете аллель встречается с частотой от 11% (у афроамериканцев Южной Каролины) до 45% (у индейцев Бразилии). В России у жителей Центрального региона частота встречаемости полиморфизма 677Т гена MTHFR составляет от 29 до 42% [Калашникова Е. А. и др., 2006; Гиляров М. Ю. и др., 2009; Avdonin P. V. et. al., 2006].

Любопытно, что ни у одного из пациентов не было выявлено носительства гомозиготного варианта по редкому аллелю гена протромбина FII G20 210A, частота встречаемости гетерозиготной формы полиморфизма не превышает 4,2%, однако эти данные не были статистически достоверными, что не совпадает с данными других российских исследований. Этот факт связан, скорее всего, с популяционными особенностями региона Западной Сибири. Известно, что частота встречаемости редкого аллеля гена протромбина в популяциях Европы и Северной Америки крайне вариабельна, от 1,2 до 4,6%. Многочисленные исследования свидетельствуют о редкой (около 1%) встречаемости полиморфизма FII среди неевропеоидного населения. Популяционное исследование, проведенное в Сан-Диего (США), показало схожие с нашими результаты — корреляции полиморфизма гена FII и повышенного риска тромбообразования не было обнаружено, такие же данные опубликовали и нидерландские ученые. Все представленные выше сведения справедливы для гетерозиготного носительства редкого аллеля; гомозиготный вариант встречается исключительно редко среди представителей всех этно-географических групп. Частота носительства аллельного в российской популяции (Центральный и Северо-Западный регион) гетерозигот и гомозигот по полиморфному маркеру G20 210A гена протромбина — 1,74% [Bosler D. et.al.,2006; Avdonin P. V. et. al., 2006; Meltzer M. E. et. al., 2008; Branco C. C. et. al., 2009].

Другие гены также не показали достоверной связи с риском развития венозных тромбозов и тромбоэмболических осложнений, что также делает необходимым продолжение исследования с дальнейшим расширением группы исследования.

Таблица 4.3. Частота встречаемости полиморфных вариантов генов системы гемостаза

Лечебно-профилактические мероприятия

Тактика лечебных мероприятий зависит от этиологии тромбофилического состояния. Так, ведение пациентов с врожденной тромбофилией будет несколько отличаться от схемы терапии у пациентов с ситуационным гиперкоагуляционным состоянием. Совершенно иные подходы к профилактике и лечению должны быть использованы в случае выявления приобретенных или сочетанных тромбофилий, развившихся на фоне различной соматической патологии.

1. Медикаментозная терапия у пациентов с врожденной тромбофилией

Проведение антикоагулянтной терапии у пациентов этой нозологической группы имеет свои особенности. При изолированном тромбозе подкожных вен носителям полиморфизмов по редкому аллелю в генах FV, FII, показано назначение прямых антикоагулянтов, предпочтительно низкомолекулярных гепаринов (НМГ), в лечебных дозах. При переходе тромботического процесса на глубокую систему НМГ должны быть назначены всем пациентам с различными видами генетически обусловленной тромбофилии. Продолжительность антикоагулянтной терапии в обоих случаях не должна быть меньше 4 нед. Если сочетанное поражение глубокой и подкожной венозных систем выявлено у пациентов с мутацией генов FV/FII, после окончания курса прямых антикоагулянтов необходимо продолжить антикоагулянтную терапию антагонистами витамина К (варфарин) с профилактической целью, при этом длительность приема непрямых антикоагулянтов не должна быть менее 6 мес, окончательное решение о продолжительности терапии принимается на основании клинических данных. Подбор дозы варфарина должен проводиться с учетом особенностей генов системы метаболизма варфарина.

Проведение антикоагулянтной терапии показано также всем пациентам с тромбозами глубоких вен на фоне врожденной тромбофилии. Пациентам, не являющимися носителями Лейденской мутации и/или полиморфных вариантов по редкому аллелю гена FII, MTHFR, парентеральное введение НМГ рекомендовано начинать с первого дня лечения, в рекомендованных производителями стандартных лечебных дозировках. Длительность лечения должна составлять не менее 7 дней. Непрямые антикоагулянты могут быть назначены с первого дня лечения на фоне введения НМГ, с отменой последних с 5-го дня, при условии достижения терапевтических значений МНО (2,0—3,0). Если непрямые антикоагулянты (варфарин) назначают отсроченно, то отмена НМГ должна произойти также на 5-й день от начала приема варфарина (при достижении адекватных значений МНО — выше 2,0). При изолированном тромбозе глубоких вен на уровне голени в сочетании со структурными изменениями в генах тромбоцитарного звена, вместо непрямых антикоагулянтов возможно назначение комбинированных препаратов, в частности сулодексида, в рекомендованных по стандарту дозировках, сроком не менее 2 мес.

В случае рецидива венозного тромбоза, а также при развитии тромбоэмболических осложнений у пациента с наличием полиморфных вариантов по редкому аллелю любого варианта FV (Лейденская мутация) и гомозиготного варианта по редкому аллелю FII (протромбин), антикоагулянтная терапия должна проводиться пожизненно. Препаратом выбора в этом случае должно быть лекарственное средство из группы непрямых антикоагулянтов (варфарин). При перенесенном тромбозе глубоких вен без тромбоэмболических осложнений, при наличии редкого аллельного варианта в генах PLAT, CBS, MTHD, MTR, MTRR, NOS, END1 длительность приема варфарина может не превышать 3 мес. После окончания этого срока необходимо оценить риски рецидива венозного тромбоза и развития тромбоэмболических осложнений. При низком риске продолжения приема непрямых антикоагулянтов не требуется, если же риск оценивается как высокий — необходимо продолжать прием варфарина еще как минимум 3 мес. Доза варфарина должна быть подобрана индивидуально, под контролем МНО, во всех случаях терапевтические значения МНО не должны опускаться ниже 2,0, но не превышать 3,0. У пациентов пожилого и старческого возраста допустимо поддерживать МНО на уровне 1,8—2,0.

Для всех пациентов, имеющих полиморфизмы по редкому аллелю в генах фолатного цикла, необходимо исследование уровня гомоцистеина. При выявлении гипергомоцистеинемии необходимо назначение препаратов фолиевой кислоты и витаминов группы В (при отсутствии аллергических реакций и соматических противопоказаний). Целесообразно назначать комбинированные препараты, в которых содержатся основные витамины группы В в сочетании с фолиевой кислотой, например, ангиовит, который в этих случаях назначают по следующей схеме — при уровне гомоцистеина до 12 ммоль/л 1 драже 1 раз в день, при уровне гомоцистеина выше 12 ммоль/л — по 2 драже 1 раз в день в течение 1 мес, повторять курсы лечения 2—3 раза в год под контролем уровня гомоцистеина плазмы крови. Если возможности исследовать уровень гомоцистеина нет, то препараты фолиевой кислоты и витаминов группы В пациентам с тромбофилией по генам фолатного цикла назначаются в профилактических дозах (минимальные рекомендованные дозы выбранного препарата).

Необходимо отметить, что проведение профилактической медикаментозной терапии у пациентов с верифицированной тромбофилией, но без свершившегося венозного тромбоза в отсутствие факторов риска нецелесообразно.

2. Медикаментозное лечение пациентов с ситуационной тромбофилией

К ситуационным тромбофилическим состояниям относятся преходящие изменения в системе свертывания крови, возникающие во время оперативного лечения, у пациентов с костно-травматическими повреждениями (в том числе и при проведении консервативного лечения), во время всего периода беременности, на фоне приема оральных контрацептивов и проведения гормоно заместительной терапии.

Необходимо помнить, что профилактика тромбоэмболических осложнений должна проводиться всем пациентам хирургического и травматологического профиля в соответствии с характером планируемого вмешательства, сроков иммобилизации и с учетом наличия индивидуальных факторов риска (масса тела, возраст, наличие ВТЭО в анамнезе и т. д.).

В случае необходимости выполнения оперативного лечения пациентам с наличием любого варианта по редкому аллелю гена FV (Лейденская мутация) и/или сочетание полиморфных вариантов по редкому аллелю генов FII, MTHFR необходимо назначение прямых антикоагулянтов, предпочтительно низкомолекулярных гепаринов — фраксипарин, клексан, фрагмин, в лечебных дозах за 12 ч до или через 2 ч после оперативного лечения любого объема. Необходимо помнить, что медикаментозная профилактика должна быть продолжена и в послеоперационном периоде. Длительность антикоагулянтной терапии в этом случае должна быть не меньше 4 нед. При симультанном поражении подкожных и глубоких вен у пациентов с верифицированным носительством Лейденской мутации (как гетерозиготного, так и гомозиготного вариантов) возможно проведение в послеоперационном периоде терапии непрямыми антикоагулянтами (варфарин), при этом прием препарата необходимо начинать одновременно с НМГ, с отменой последних через 5 дней (при достижении терапевтических значений МНО — 2,0—3,0). Длительность лечения непрямыми антикоагулянтами в послеоперационном периоде должна составлять не менее 6 мес.

Если стоит вопрос о проведении оперативного лечения по поводу венозного тромбоза и/или развившихся тромбоэмболических осложнений у пациентов с верифицированной тромбофилией — мутация Лейден, гомозиготный полиморфзим FII, сочетание полиморфизмов указанных генов с редкими аллелями гена MTHFR (при наличии гипергомоцистеинемии), рекомендовано смещать выбор тактики лечения в неоднозначных случаях в сторону оперативного лечения. В послеоперационном периоде необходимо пролонгированное назначение непрямых антикоагулянтов, длительность терапии определяется характером и объемом вмешательства и особенностями генотипа, но не менее 2 нед.

Пациентам, нуждающимся в длительной иммобилизации, необходимо также назначать прямые антикоагулянты, при этом применение нефракционированного гепарина нежелательно, так как на фоне его пролонгированного приема возможно угнетение тромбоцитарного звена со снижением уровня тромбоцитов в плазме крови, что чревато развитием геморрагических осложнений. Низкомолекулярные гепарины более безопасны, не требуют жесткого контроля значений АПТВ и уровня тромбоцитов, что делает возможным их назначение длительными курсами. Если у пациента не выявлены мутации в генах FV, FII, MTHFR, то НМГ целесообразно назначать в рекомендованных производителем профилактических дозах, при этом длительность антикоагулянтной терапии определяется сроком предполагаемой иммобилизации, но не менее 10 дней. При наличии структурных изменений в генах V фактора, протромбина и/или метилентетрагидрофолатредуктазы доза антикоагулянта должна быть повышена до лечебных значений без изменения сроков лечения. У носителей мутации Лейден в гомозиготном варианте по редкому аллелю антикоагулянты должны быть назначены на весь срок иммобилизации. Контроль за эффективностью лечебно-профилактических мероприятий осуществляется с помощью исследования показателей периферического гемостаза, в первую очередь РФМК и Д-димера. Если на фоне антикоагулянтной терапии эти маркеры остаются на одном уровне или продолжают повышаться, необходимо проводить коррекцию дозы препарата в сторону увеличения. Прекращать медикаментозную поддержку на фоне высокого уровня РФМК и Д-димера нельзя, необходимо продолжать управляемую гипокоагуляцию до нормализации показателей.

Профилактические и лечебные мероприятия как при наличии врожденной тромбофилии, так и на фоне обратимых тромбофилических ситуаций, должны быть комплексными и, помимо медикаментозной поддержки, должны обязательно включать в себя компрессию в виде прерывистой пневмокомпрессии или использования компрессионного трикотажа 2-го класса, раннюю активизацию пациентов, проведение лечебной физкультуры.

Таким образом, структурные изменения в генах системы гемостаза приводят к нарушению равновесия между протромботическими и противотромботическими факторами свертывания крови. Носительство отдельных полиморфных вариантов требует изменения тактики лечения и профилактики по сравнению с существующими стандартными рекомендациями. Наличие, в частности, редкого аллельного варианта V коагуляционного фактора (мутация Лейден) предполагает высокий риск тромбообразования, даже без участия внешних провоцирующих факторов, более тяжелое течение процесса, частое развитие тяжелых, порой фатальных, осложнений основного заболевания. Очевидно, что для этой категории пациентов необходимо проведение увеличения дозы и длительности применения антикаогулянтов (как НМГ, так непрямых антикоагулянтов), кроме того, при выявлении подобных генетических особенностей, решение по ведению пациента, в сомнительных случаях, должно быть принято в пользу активных хирургических действий. Проведение молекулярно-генетического исследования у всех категорий пациентов с тромбоэмболическими осложнениями, позволяет выбрать наиболее оптимальный вид оперативного или консервативного лечения, подобрать безопасную и адекватную дозу антикоагулянтных препаратов (варфарин).

Предлагаемые алгоритмы диагностики, лечения и профилактики обеспечивают персонализированный подход к ведению пациентов, в котором учитываются индивидуальные особенности каждого пациента, что позволяет повысить эффективность и безопасность проводимого лечения, снизить риск рецидивов тромбоэмболии, в том числе фатальных, а также сократить число инвалидизирующих форм течения заболевания.